線粒體膜電位熒光探針是一種廣泛用于檢測線粒體膜電△Ψm位的理想熒光探針。染料以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內，可以用來檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。正常線粒體內，聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發出強烈的紅色熒光(Ex=585 nm, Em=590 nm)；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，只能以單體的形式存在于胞漿中，產生綠色熒光(Ex=514 nm, Em=529 nm)。不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。觀察時，只需使用常規的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。
 

　　線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過線粒體膜電位熒光探針從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用它從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。
 

　　線粒體膜電位熒光探針使用方法：
 

　　1. 工作液配制：
 

　　1)粉末(5 mg)：直接加1 mL DMSO到粉末內，室溫顛倒混勻使其充分溶解，即得到5 mg/mL的儲存液。溶液分裝成小量儲存于-20℃，避光干燥，避免反復凍融。
 

　　2)儲存液(1 mg in DMSO)：本品是JC-1的DMSO儲存液，濃度為5 mg/mL。使用者需要根據單次用量來分裝，-20℃避光干燥，避免反復凍融。
 

　　3)工作液配制：將凍存的儲存液置于室溫充分融化，之后用緩沖液或者預熱的培養基直接稀釋儲存液(5 mg/mL)到需要的工作液濃度，邊震蕩邊稀釋，充分混勻。為了去除任何不溶顆粒，建議13,000 x g離心JC-1工作液1 min，小心吸取上清轉移到新的管子內。整個過程要避光操作。注意：因JC-1不溶于水，很可能在稀釋到工作液的過程中形成聚集顆粒，則建議細胞染色前用離心或者過濾的方法去除這些顆粒后再使用。
 

　　2. 染色步驟(流式細胞儀)
 

　　1)于6-，12或24-孔板上進行細胞鋪板，密度為5×105 cells/mL。37℃，5%CO2培養箱培養過夜。選擇合適的化合物根據特定的步驟進行凋亡誘導。 注：進行凋亡誘導時的細胞密度建議不超過1×106 cells/mL，也可根據自己的細胞類型培養至合適的密度。
 

　　2)取0.5 mL細胞懸液至無菌的離心管內；
 

　　3)室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清。
 

　　4)用0.5 mL JC-1工作液重懸細胞，于37℃，5%CO2培養箱孵育15-30 min；注意：一般情況，15 min足以進行充分的染色。
 

　　5)室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清；
 

　　6)用2 mL細胞培養液或者緩沖液重懸細胞，之后室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清；
 

　　7)重復步驟6)；
 

　　8)用0.5 mL新鮮培養液或者緩沖液重懸細胞，即可進行后續的流式分析。注意：請馬上進行流式定量分析，此細節很重要。
 

　　數據分析：含有紅色JC-1聚集物的健康細胞線粒體用FL2通道檢測；含有綠色JC-1單體的凋亡或不健康細胞用FL1(FITC)通道檢測。
 

　　3. 染色步驟(熒光顯微鏡)
 

　　A.懸浮細胞
 

　　1)-6)同上JC-1染色步驟(流式細胞儀)；
 

　　7)用0.3 mL的緩沖液重懸細胞，即可進行熒光顯微鏡檢測。注意：請馬上進行熒光顯微分析，此細節重要。
 

　　B.貼壁細胞
 

　　1)培養皿內用蓋玻片進行細胞爬片或者細胞培養在腔室玻片(chamber slide)上。選擇合適的化合物根據特定的步驟進行凋亡誘導。
 

　　2)染色前開始配制工作液，配制步驟見上。
 

　　3)吸掉細胞培養液，然后加入足夠覆蓋所有細胞的工作液。于37℃，5%CO2培養箱孵育15-30 min；注意：一般情況，15 min足以進行充分的染色。
 

　　4)吸掉培養液，然后用合適的緩沖液來清洗細胞2次。
 

　　5)加入2 mL細胞培養液(培養液可含有血清和酚紅)或者PBS緩沖液，于熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察。數據分析同A. 懸浮細胞。
 

　　注意事項：
 

　　1)線粒體膜電位熒光探針是光敏感性的，所有染色步驟的操作過程中避免強光接觸。
 

　　2)染色完成后，立即進行后續的結果分析非常必要；
 

　　3)為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

　　4)本產品僅供科研使用。請勿用于醫藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區。