熒光探針優點是：一方面可以被氬離子激光(argon-ion laser)的488nm激發光激發，便于檢測；另一方面，和鈣離子結合后熒光變化更強，即對鈣離子濃度變化的檢測更加靈敏；同時，和鈣離子的結合能力較弱，這樣可以比Fura-2檢測到細胞內更高濃度的鈣離子水平；此外，對于細胞內的鈣離子的即時變化反應得更加準確，減小了因為和鈣離子解離速度慢而導致的熒光變化滯后。
 

　　熒光探針使用方法(僅作參考)
 

　　以下步驟是來源于大量文獻總結的簡易操作流程，僅作參考。用戶需根據特定的應用和敏感性來做調整。
 

　　1)將低溫保存的凍干粉取出回至室溫，低速離心使粉末落到瓶底。之后加入適量無水DMSO或其他有機溶劑配制成1-10mM儲存液。未用完的DMSO儲存液需分裝并避光凍存在-20℃，避免反復凍融。
 

　　2)于正式實驗前，用生理鹽緩沖液(比如：PBS，HBSS，HEPES)稀釋到工作濃度1-10μM。需根據具體應用來調整合適的工作濃度。
 

　　3)吸走培養液，加入步驟2)配制的染色工作液到細胞內，室溫或30℃孵育5~60min。
 

　　4)吸走染色工作液，用預熱的生理緩沖液或細胞培養液清洗一遍。重新加入預熱的生理緩沖液或細胞培養液，在適宜溫度內孵育。對于二乙酸酯衍生物，需要短暫復原時間讓細胞內酯酶將其水解，從而讓染料對氧化應激產生反應。復原時間范圍很廣，由于某些細胞類型通常顯示極其低水平的酯酶活性。
 

　　5)將細胞暴露于實驗刺激物之前，先測定加載細胞的背景熒光強度。
 

　　6)根據以下情況評估陰性對照(Negativecontrol)
 

　　6.1 綠色發射光譜內檢查未染色細胞的自熒光情況。
 

　　6.2 對于流式分析，查明染料加載和處理后細胞的前向角散射和側向角散射是不變。細胞尺寸的變化可能與起泡或萎縮有關，由于處理或有毒反應引起的。
 

　　6.3 對包含和不包含刺激物的染料和緩沖液/培養基的無細胞混合物進行熒光檢測。在不含細胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨著時間熒光的逐漸增加可能與瞬間水解、空氣氧化、和/或光誘導氧化有關。
 

　　6.4 檢查培養在生長培養液或簡單緩沖液內的未處理加載細胞(對照)的熒光。在健康細胞內，細胞內酶和/或天然抗氧化劑會清除這些氧自由基。經過染料加載復原時間后，健康細胞應該表現出低水平的熒光信號，且在整個實驗期間相對穩定。然而，逐漸增加(由于自氧化)或降低(由于細胞內染料喪失或光淬滅)也有可能觀察到。在不含任何刺激物或誘導劑的體系內，健康和未處理細胞突然發現強熒光，表明細胞發生死亡或一些其他的氧化事件。
 

　　7)建立陽性對照(Positivecontrol)，可能用以下方法刺激氧化活性：
 

　　7.1 腫瘤促進劑(PMA，工作濃度100pM~10μM)
 

　　7.2 H2O2或TBHP(終濃度~100μM)(根據細胞本身對其的靈敏度和反應性來提高或降低濃度)
 

　　8)確保刺激藥物或化合物不會引起染料熒光淬滅。檢查化合物的吸收光譜，確定化合物的吸收峰不會與氧化后染料的大激發或發射光譜發生重疊。
 

　　保存條件：
 

　　-20℃避光保存，6個月有效。
 

　　熒光探針使用注意事項：
 

　　本Fluo-3 AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
 

　　熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
 

　　本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。